Células-tronco mesenquimais autógenas cultivadas em cultura como potencializadores da formação óssea em enxertos ósseos

1. Objetivos e Hipótese Baseado em estudos previamente relatados e seguindo uma abordagem translacional, foi considerada a hipótese de que o efeito parácrino ligado aos fatores de crescimento e citocinas autógenas cultivadas em concentrações fisiológicas, atuando localmente nos locais enxertados, poderia promover uma resposta celular mais rápida e/ou eficiente e, consequentemente, induzir uma formação óssea mais significativa/rápida. A presença dessas moléculas adicionadas aos substitutos ósseos sintéticos poderia atuar positivamente em termos de recrutamento celular local (quimiotaxia), proliferação, diferenciação e síntese de proteínas ósseas. Além disso, os riscos biológicos recorrentes envolvidos em compostos de enxerto celular de engenharia tecidual convencional, geralmente relacionados à manipulação ex vivo de células em termos de tumorigenicidade, imunogenicidade e ao fenômeno de dediferenciação celular previamente relatado, seriam mitigados pela exclusão do elemento celular desse processo, pois, de acordo com alguns relatos, elas são consideradas apresentar um comportamento mitótico imprevisível uma vez artificialmente cultivadas. O presente estudo tem como objetivo estender ainda mais essa investigação translacional após estudos pré-clínicos realizados pelo principal investigador, propondo um ensaio clínico controlado randomizado prospectivo sobre os possíveis benefícios associados à aplicação de um composto de enxerto ósseo de engenharia tecidual contendo meio de cultura celular autógeno concentrado (CM) e um substituto ósseo sintético à base de hidroxiapatita/beta-fosfato tricálcico (cerâmica HP/β-TCP). Os objetivos específicos incluem análises da densidade do tecido calcificado recém-formado por tomografia computadorizada (CBCTs), expressão de marcadores específicos de formação óssea imunohistoquímica (RT-PCR) e avaliação da quantidade óssea histomorfométrica. Em um modelo de estudo de boca dividida, a formação óssea resultante após o enxerto de HP/β-TCP com e sem CM será analisada, comparada e quantificada em diferentes momentos. 2. Materiais e Métodos 2.1 - Desenho do estudo Um ensaio clínico controlado randomizado prospectivo de boca dividida foi escolhido como desenho do estudo para a presente investigação. Após a aprovação do protocolo pelo Comitê de Ética em Pesquisa e registro na plataforma clinicaltrials.gov, seguindo as diretrizes CONSORT, 20 pacientes consecutivos que buscam reabilitação oral maxilar no Departamento de Prótese Dentária da Escola de Saúde e Ciências da Vida - PUCRS, Brasil, serão convidados a participar da presente investigação. 2.2 - Lipoaspiração e colheita/cultura de células-tronco adiposas humanas (hASCs) Para a colheita de hASCs, será proposto e realizado um procedimento de lipoaspiração abdominal após consentimento informado assinado. Sob sedação intravenosa e liberação suplementar de oxigênio com um cateter oral, juntamente com anestesia local, será realizado um procedimento cirúrgico padrão de lipoaspiração. Conforme previamente descrito, desse material de lipoaspiração, 25 a 30 ml de gordura será transferida para um tubo Falcon de 50 ml. A gordura será então lavada por centrifugação (430Å~g 10 min), sendo a camada de gordura superior transferida para um novo tubo Falcon, onde um volume igual de solução de colagenase será adicionado à mistura e incubado a 37°C em banho-maria. Após a centrifugação, a camada de gordura superior será descartada e o sobrenadante removido. O pellet celular restante contendo as hASCs será ressuspendido com 15 ml de meio de cultura. Após adição de 15 ml de meio de cultura aquecido, a suspensão celular será transferida para um frasco de cultura T175. As hASCs serão incubadas em um ambiente umedecido a 37°C e 5% de CO2. Em seguida, o pellet celular será ressuspendido em meio de cultura aquecido e semeado em novos frascos de cultura celular. 2.3 - Preparação e análise do meio de cultura concentrado (CM) A cultura de células-tronco e a preparação do CM serão realizadas em uma instalação certificada de Boas Práticas de Fabricação (GMP) para produtos de medicina regenerativa. Inicialmente, os perfis de antígenos de superfície das hASCs isoladas na terceira passagem serão caracterizados por citometria de fluxo. A presença dos marcadores CD73, CD90, CD105 e CD44 e a ausência de CD34, CD45, CD11b, CD19 e HLA-DR serão avaliadas para confirmar o fenótipo celular desejado, conforme recomendado pelos protocolos da Sociedade Internacional de Terapia Celular. Em seguida, uma amostra dessas células será também caracterizada por coloração (Alizarina Red S) de acordo com as instruções do fabricante. A expansão celular e o CM serão gerados seguindo protocolos padrão de cultura de células-tronco. Antes do uso clínico, o CM será examinado não apenas quanto à contaminação por bactérias, fungos ou micoplasmas, mas também quanto à infecção por vírus, incluindo hepatite B e C, vírus da imunodeficiência humana e vírus da leucemia de células T humanas. Em seguida, o CM será armazenado adequadamente e enviado para aplicação clínica (até 6 horas) para evitar desnaturação/inativação a longo prazo das moléculas sinalizadoras presentes, como sugerido anteriormente. 2.4 - Procedimento de elevação do assoalho do seio maxilar Sob sedação intravenosa e liberação suplementar de oxigênio com um cateter oral, juntamente com anestesia local, o osso maxilar será enxertado internamente perfurando um acesso na parede lateral do seio maxilar. A dissecção da membrana sinusal com liberação cuidadosa e elevação também será realizada. A randomização pré-operatória por números aleatórios gerados por computador será usada para determinar os seios testados e de controle para cada paciente. O assoalho ósseo do seio maxilar no local de teste será aumentado com 4 a 5g de um substituto ósseo sintético (Cerâmica Óssea™ 1-2 mm) misturado com 10 a 15 ml de CM. O local de controle receberá uma quantidade similar de substituto ósseo incorporado em 10 a 15 ml de solução salina. Os pacientes serão liberados da instalação hospitalar 2 horas após a cirurgia. Eles receberão instruções sobre higiene pós-operatória e comportamento alimentar. Todos os pacientes receberão terapias antibiótica e anti-inflamatória pós-operatórias. 2.5 - Colocação de implantes e colheita de biópsias ósseas Após 6 meses de cicatrização, a colocação de implantes seguirá protocolos cirúrgicos padrão recomendados pelo fabricante do implante. Sob anestesia local, será realizada uma incisão linear de crista média e retalho de espessura total com incisões liberadoras sempre que necessário. Em seguida, com um contra-ângulo 16:1 acoplado a uma unidade cirúrgica e uma broca de trépano (Ø 3mm), a área enxertada correspondente aos locais do 2º pré-molar, 1º e 2º molares será biopsiada nos lados direito e esquerdo da maxila (n=06 sítios por paciente), guiada por uma moldeira cirúrgica de resina acrílica previamente feita. As biópsias ósseas serão então divididas em dois segmentos, onde uma será armazenada em solução de formaldeído a 4% para análise histológica e a outra em tubos de Eppendorf com RNALater para análise de RT-PCR. Em seguida, a sequência de brocas cirúrgicas de implante como recomendado pelo fabricante será seguida para a colocação de 6 a 8 implantes por paciente. O registro da estabilidade primária na inserção será feito tanto por chave de torque manual quanto classificado em três grupos. Um pilar de cicatrização será então colocado, e o fechamento da ferida será realizado com material de sutura não reabsorvível. Um protocolo de cicatrização de um estágio de 6 meses será adotado para todos os implantes. 2.6 - Análise de imagem CBCT Imagens CBCT de alta resolução serão obtidas em três momentos diferentes como parte do protocolo de tratamento, ou seja, no enxerto ósseo pré-operatório [linha de base], 90 [T1] e 180 [T2] dias (pré-operatório da colocação do implante), visando tanto o planejamento cirúrgico pré-operatório quanto a avaliação pós-operatória da formação óssea. Os parâmetros ósseos morfométricos serão calculados em análise 3D de acordo com as recomendações da Sociedade Americana de Pesquisa Óssea e Mineral (ASBMR) como previamente proposto, e a análise estatística será usada para identificar as melhores combinações de parâmetros visando diferenciar o osso trabecular em três categorias ósseas: (i) esparsa - relacionada a uma estrutura óssea solta, (ii) intermediária - relacionada a um osso trabecular bem estruturado e (iii) tipos de osso denso - relacionados a uma área óssea maciça com pouco espaço entre as trabéculas. 2.7 - Análises histológicas e histomorfométricas Após a remoção das biópsias de enxerto na colocação do implante, blocos ósseos contendo os locais de controle e teste serão moldados e descalcificados com 5% de HNO3. Os blocos serão desidratados em uma série de álcool graduada, clarificados com xileno e embutidos em resina. Em seguida, a resina será polimerizada em uma câmara de luz UV por 10 horas. Usando uma micro serra de diamante, um total de três seções de 3 μm de espessura de cada bloco serão moídas transversalmente ao longo do eixo longo de cada espécime a 50, 100 e 150 μm de sua porção externa. Após isso, será realizada coloração de rotina com hematoxilina-eosina (HE), Azur II e Pararosanilina com o objetivo de diferenciar entre partículas de HP/β-TCP e osso recém-formado. A análise microscópica será realizada a 24X de aumento usando um microscópio estéreo óptico conectado a uma câmera digital. A análise de imagem será realizada usando o software ImageJ®. 2.8 - Reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) Após a preparação das biópsias de enxerto coletadas para extração de RNA, a análise da reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) será aplicada para quantificar a fosfatase alcalina, fator de crescimento endotelial vascular, osteonectina, osteopontina e colágeno tipo 1.